Филатов М.В., Мельник А.М., Дворянчиков В.В. Современные подходы к лечению аллергических ринитов

Скачать статью в формате PDF

Дата публикации 01.06.2018 г. 

УДК: 616.211

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РИНИТОВ

 М.В. Филатов¹, А.М. Мельник², В.В. Дворянчиков³

Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН,

Санкт-Петербург¹

Научно-исследовательский центр курортологии и реабилитации – филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Северо-Кавказский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», Сочи²

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург³

Ключевые слова: аллергический ринит, дендритные клетки.

Аннотация. В ходе научно-исследовательских изысканий была разработана концепция о медицинской технологии использования дендритных клеток для лечения аллергий. Полученные из клеток крови пациента дендритные клетки, нагружались аллергенами, приводящими к аллергическим реакциям. Полученные таким образом клетки данного человека возвращались ему путем внутрикожной инъекции. По-существу, предлагаемая процедура является усиленным вариантом широко используемого метода гипосенсибилизации. Однако, использование дендритных клеток в сочетании с активированными лимфоцитами привело к радикальному повышению эффективности предлагаемого подхода.

PROSPECTS FOR THE TREATMENT OF ALLERGIC RHINITIS BASED ON HIGH TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS

M.V. Filatov¹, A.M. Melnik², V.V. Dvorianchikov³

Petersburg Nuclear Physics Institute. B.P. Konstantinova Russian Academy of Sciences, St. Petersburg¹

Research Center of balneology and rehabilitation – a branch in Sochi FGBI «North Caucasian Federal Scientific Clinical Center FMBA», Sochi²

Military Medical Academy C.M. Kirova, St. Petersburg³

Key words: allergic rhinitis, dendritic cells.

Abstract. In the course of scientific research, a concept was developed on the medical technology of using dendritic cells to treat allergies. Dendritic cells, obtained from the patient's blood cells, were loaded with allergens, leading to allergic reactions. The cells of the given person thus obtained were returned to him by intradermal injection. In essence, the proposed procedure is an enhanced version of the widely used method of hyposensitization. However, the use of dendritic cells in combination with activated lymphocytes led to a radical increase in the effectiveness of the proposed approach.

Введение. Аллергия является глобальной медицинской проблемой, так как около 25% населения некоторых индустриальных районов страдает каким-либо аллергическим заболеванием, распространенность аллергии неуклонно растет во всем мире, что видимо связано с глобальными экологическими изменениями в среде обитания человека [3].

Аллергические реакции связаны с аномальным гуморальным иммунным ответом на тот или иной антиген. Избыточная продукция иммуноглобулинов (антител) типа Е – IgE, которые связываются со специфическими рецепторами (FcRε1) на поверхности базофилов и тучных клеток, приводит к тому, что значительная часть этих клеток оказывается нацеленной на узнавание определенного специфического молекулярного агента, попадающего в организм [2, 12]. При его появлении происходит активация этих клеток с выбросом биологически активных веществ, обуславливающих целый ряд последующих реакций на клеточном, системном и организменном уровнях.

Одним из способов предотвращения аллергических реакций может быть выработка на попадающий в организм аллерген иммунного ответа другого типа. Это может быть выработка антител иного изотипа, например, иммуноглобулинов G (IgG) или формирование преимущественно клеточного иммунного ответа, который подавляет избыточную продукцию антител. Этот путь довольно давно применяется аллергологами и известен как гипосенсибилизация, или десенсибилизация. В этом подходе используется известный факт, что антигены, попадающие в организм через кожу, в отличие от попадающих через слизистые, вызывают преимущественно клеточный иммунный ответ и могут подавлять избыточную продукцию IgE вместе со связанными с ней аллергическими реакциями [1, 7]. Гипосенсибилизация, по-существу, представляет собой специфическую форму иммунотерапии, при которой пациент постепенно вакцинируется нарастающими дозами специфического антигена, вызывающего аллергическую реакцию. Это может привести как к снижению тяжести, так и к полной ликвидации гиперчувствительности. Но, как показала длительная общественная (клиническая) практика, такой подход не всегда является эффективным и качественным.

В 2011 году Ральф Штейнман, был удостоен Нобелевской премии за обнаружение дендритных клеток и их уникальную способность активировать и регулировать адаптивный иммунитет. Достижения последних лет привели к новым медицинским технологиям, основанным на «эксплуатации» дендритных клетках [2, 11]. Дендритные клетки представляют собой профессиональные антиген-представляющие клетки иммунной системы, которые способны как стимулировать, так и подавлять иммунный ответ. Использование иммунорегуляторного потенциала дендритных клеток является многообещающим для лечения онкологических заболеваний, аутоиммунных болезней и предотвращения отторжения трансплантатов. Клинические испытания показывают, что вакцины на основе дендритных клеток могут эффективно вызывать иммунный ответ против тех антигенов, которые были им представлены [4, 6, 8, 9,11].

Дендритные клетки, как и другие клетки макрофагального ряда, происходят из костного мозга [2]. Уникальным их свойством является способность с высокой эффективностью захватывать и перерабатывать потенциальный антигенный материал. При этом они мигрируют в ближайший лимфатический узел, где они представляют захваченный антиген лимфоцитам, сопровождая это соответствующими молекулярными сигналами. Захватом и переработкой антигенов занимаются незрелые дендритные клетки, но для эффективной стимуляции Т-клеточого иммунного ответа они должны созреть в полностью активированные дендритные клетки, которые экспрессируют на поверхности высокий уровень главных комплексов гистосовместимости (МНС) и костимуляторных молекул. В организме дендритные клетки играют роль стражников фактически во всех тканях, где они сталкиваются с потенциальными антигенами. Даже очень малое число дендритных клеток способно вызвать эффективный иммунный ответ против вирусов, других патогенов и раковых клеток [8, 11].

Вакцины на основе дендритных клеток представляют собой изолированные дендритные клетки, нагруженные антигеном (Рисунок 2), таким, например, как антигены, связанные с опухолевыми клетками. При введении пациенту такие дендритные клетки должны мигрировать в лимфатические узлы и вызывать специфичный для введенного антигена Т-клеточный иммунный ответ. Первое сообщение о клинических испытания вакцин на основе дендритных клеток появилось в 1996 году [5]. Сегодня значительное число вакцин на основе дендритных клеток используется для стимуляции иммунного ответа против различных опухолевых заболеваний.

В Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова совместно с Российским научно-исследовательским нейрохирургическим институтом им. А.Л. Поленова в течение более 12 лет проводятся работы по использованию дендритных клеток в лечении злокачественных опухолей центральной нервной системы. Патент на изобретение № 2192263 «Способ лечения злокачественных опухолей головного мозга», приоритет от 17.08.2000 по заявке № 200122041.

В ходе научно-исследовательских изысканий была разработана концепция о медицинской технологии использования дендритных клеток для лечения аллергий. Полученные из клеток крови пациента дендритные клетки, нагружались аллергенами, приводящими к аллергическим реакциям. Полученные таким образом клетки данного человека возвращались ему путем внутрикожной инъекции. По-существу, предлагаемая процедура является усиленным вариантом широко используемого метода гипосенсибилизации. Однако, использование дендритных клеток в сочетании с активированными лимфоцитами привело к радикальному повышению эффективности предлагаемого подхода.

Целью исследования было изучение эффективности и безопасности терапевтической вакцины на основе дендритных клеток в комплексном лечении больных с аллергическим риносинуситом.

Методы и организация исследования. Перед каждым введением композиции для ее изготовления производят забор 40-60 мл периферической крови больного в вакуумные пробирки (вакутейнеры) с гепарином. Кровь поступает на обработку не позднее 36 часов после забора. Из взятой крови известными методами выделяют мононуклеарные лейкоциты, которые культивируют при 37˚С в среде RPMI1640 с добавлением 10% человеческой сыворотки, полученной от доноров с 4-й группой крови.

Выделение моноцитов и лимфоцитов осуществляют путем центрифугирования на ступенчатом градиенте фикол-урографина (плотность раствора 1,077 г на мл) с последующим прикреплением моноцитов к поверхности культуральных флаконов. Обычно, в зависимости от пациента, получается 0,5-1 х 10⁷ моноцитов. 

Для индукции образования дендритных клеток во флаконы с питательной средой, в которой культивируются полученные моноциты, добавляют ростовые факторы: 1) гранулоцит-макрофаг колоний-стимулирующий фактор (GM-CSF) в концентрации 3000 ед/мл, (в качестве которого возможно использовать фармакологические препараты «Лейкомакс» и «Сарграмостим») и 2) интерлейкин 4 (IL4) в концентрации 500 ед/мл, который может быть заменен на интерлейкин 15 (IL15) или интерферон-альфа (роферон, интрон-А).

На 4-5 день в среду к полученным дендритным клеткам добавляют (в конечной концентрации 1 микрограмм на мл) антигенный материал. Принудительное введение аллергена в клетки осуществляется с помощью прибора для электропорации фирмы «Eppendorf» или другой аналогичной техники. Для реализации электропорации в стандартную кювету, имеющую расстояние между плоскими электродами 0,5 см наливается 0,4 мл суспензии клеток в физиологическом растворе с добавлением аллергена (1 микрограмм в мл). Электропорация осуществляется при напряжении 300 вольт и времени импульса 250 микросекунд.

Для индукции полного созревания дендритных клеток после введения антигена их в течение 1 суток культивируют в питательной среде с добавлением провоспалительных сигналов: либо кондиционированную среду, полученную от культивировния аутологичных мононуклеаров, либо бактериальный липополисахарид в количестве 0,1-0,3 мкг/мл, либо смесь цитокинов TNFa+IL1b (по 500 ед/мл каждого).

Подтверждением получения истинных дендритных клеток служат следующие критерии (определяемые с помощью флуоресцентного микроскопа или техники проточной цитометрии):

а) рост в неприкрепленном к субстрату состоянии (в отличие от макрофагов, которые плотно прикрепляются к субстрату);

б) наличие характерной морфологии дендритных клеток, несущих множественные отростки;

в) появление значительного количества поверхностных маркеров свойственных дендритным клеткам (HLA-DR, HLA-ABC, CD80, CD83).

Одновременно с приготовлением дендритных клеток из той же порции крови получают активированные Т-лимфоциты, для чего из 20 мл крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности по стандартной методике выделяют мононуклеарные лейкоциты и с помощью фитогемагглютинина (20 микрограмм/мл) активируют к пролиферации содержащиеся в этой клеточной смеси Т-лимфоциты в соответствии с известной процедурой.

Активирование Т-лимфоцитов осуществляют путем их обработки фитогемагглютинином (в концентрации 1 мкг на мл).  Для преимущественной стимуляции Тh1-клеточного пути иммунного ответа к клеткам добавляется бактериальный липополисахарид (0,2 мкг на мл). Полученные активированные лимфоциты (3-5х10⁷ клеток)  и дендритные клетки (0,5-1х10⁷ клеток), несущие вирусный антиген смешиваются для получения заявляемой композиции. Полученная смесь клеток вводится больному путем внутрикожной инъекции.

Курс применения Композиции дендритных клеток и активированных Т лимфоцитов для лечения аллергий от 3 до 5 недель с еженедельным забором крови и приготовлением порций заявленной композиции. Активированные лимфоциты и дендритные клети в количестве 5х10⁵-10⁷ клеток/мл, нагруженные аллергеном в стерильных условиях, фасуются в пластиковые ампулы вместимостью 1,5 мл. Композиция дендритных клеток подлежит хранению в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С (в холодильнике). Препарат, подвергшийся замораживанию, использованию не подлежит. Транспортировка осуществляется в термоконтейнере. Допускается транспортировка при температуре до 25°С в течение 12 часов.

Результаты исследования и их обсуждение. Изучение эффективности применения «дентритной вакцины» в купировании проявлений сезонного аллергического риносинусита у 15 пациентов в возрасте от 30 до 56 лет, имеющих длительный анамнез заболевания без какого-либо другого вида противоаллергического лечения.

Оценка эффективности проводилась по показателям, характеризующем снижение доли иммунных комплексов, содержащих IgE, переключение иммунного ответа с Th2 на Th1, исчезновение клинических аллергических проявлений.

Предварительные данные проведенных научных исследований показали положительные результаты по всем вышеизложенным критериям уже после 2-3 инъекций дендритной вакцины.

Следует отметить, что предлагаемый способ лечения, по существу, является вариантом аутогемотерапии, так как вводимый препарат представляет собой комбинацию компонентов крови данного больного. И именно данный вариант аутогемотерапии позволяет модифицировать характер иммунного ответа у больных хроническим полипозным риносинуситом.

Заключение. Таким образом, мы предлагаем новую комбинацию методологических подходов, что позволяет оценить характер иммунного ответа у пациентов методом динамического рассеяния света и модификацированной реакции бласт-трансформации Т-лимфоцитов с интерлейкином-4. Исследование продолжается и об эффекте вакцинации в отдаленном периоде будет сообщено дополнительно.

 

 

Список литературы

1. Banchereau J. Dendritic cells and the control of immunity / J. Banchereau, R.M.Steinman // Nature. – 1998. – Vol. 392. – P. 245-252.
2. Banchereau J. Immunobiology of dendritic cells / J. Banchereau, F. Briere, C. Caux [et al.] // Annu Rev Immunol. – 2000. – Vol. 18. – P. 767-811.
3. Devereux G. The increase in the prevalence of asthma and allergy: food for thought / G. Devereux // Nat Rev Immunol. – 2006. – Vol. 6. – P. 869-874.
4. Diamond M.S. Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors / M.S. Diamond [et al.] // J Exp Med. 2011; 208:1989–2003.
5. Hsu F.J. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells / F.J. Hsu, C. Benike, F. Fagnoni [et al.] // Nat Med. – 1996. – Vol. 2. – P. 52-58.
6. Liu Y.J. TSLP: an epithelial cell cytokine that regulates T cell differentiation by conditioning dendritic cell maturation // Y.J. Liu, Soumelis, N. Watanabe [et al.] // Annu Rev Immunol. – 2007. – Vol. 25. – P. 193-219.
7. Moser M. Dendritic cell regulation of T_H1–T_H2 development / M. Moser, K.M. Murphy // Nat Immunol. – 2000. – Vol. 1. – P. 199-205.
8. Pulendran B. Programming dendritic cells to induce T_H2 and tolerogenic responses // B. Pulendran, H. Tang, S. Manicassamy // Nat Immunol. – 2010. – Vol. 11. – P. 647-55.
9. Soumelis V. Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP / V. Soumelis, P.A. Reche, H. Kanzler [et al.] // Nat Immunol. – 2002. – Vol. 3. – P. 673-80.
10. Sokol C.L. A mechanism for the initiation of allergen-induced T helper type 2 responses / C.L. Sokol, G.M. Barton, A.G. Fair, R. Medzhitov // Nat Immunol. – 2008. – Vol. 9. – P. 310–318.
11. Steinman R.M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future // R.M. Steinman // Annu Rev Immunol. – 2012. – Vol. 30. – P. 1-22.
12. Tomoki I. Cellular and Molecular Mechanisms of TSLP Function in Human Allergic Disorders - TSLP Programs the «Th2 code» in Dendritic Cells / I. Tomoki, L. Yong-Jun, A. Kazuhiko // Allergol Int.–2012.–Vol. 61,№ 1.–P.35-43.

Сведения об авторах. Михаил Валентинович Филатов – канд. биол. наук, заведующий лаборатории клеточной биологии Института ядерной физики им. Б.П. Константинова, Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Александр Михайлович Мельник – канд. мед. наук, в.н.с. НИЦКиР ФФГБУ СКФНКЦ ФМБА России в г. Сочи, Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Владимир Владимирович Дворянчиков – заслуженный врач РФ, д-р. мед. наук, профессор, начальник кафедры отоларингологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, главный оториноларинголог МО РФ, Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript..