Петрова Е.С. Противоишемическая защита миокарда с применением современных способов органотерапии

Скачать статью в формате PDF

Дата публикации 01.06.2018 г. 

УДК 616.1

ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКАЯ ЗАЩИТА МИОКАРДА С ПРИМЕНЕНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ СПОСОБОВ ОРГАНОТЕРАПИИ

Е.С. Петрова

Научно-исследовательский центр курортологии и реабилитации - филиал ФГБУ «Северо-Кавказский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», Сочи

Ключевые слова: кардиология, органотерапия, противоишемическая защита миокарда.

Аннотация. В последние десятилетия интенсивно стали развиваться инновационные биомедицинские технологии. Среди них широкое распространение получили методы клеточной, тканевой и органной восстановительной терапии, показавшие свою эффективность в лечении заболеваний сердца. Одним из направлений этих технологий является применение биологически активных веществ (БАВ) ксеногенного происхождения, полученные путем изолированной экстракорпоральной перфузии рабочего миокарда лабораторных или сельскохозяйственных животных. В экспериментах на мелких лабораторных животных (крысы линии CD) одноразовое введение БАВ увеличивало противоишемическую резистентность миокарда в ~2 раза, а при медикаментозном отравлении, вызывающем у приматов все признаки острого поражения миокарда, эффект действия БАВ проявлялся в уменьшении зоны и глубины ишемического повреждения.

ANTIISCHEMIC MYOCARDIAL PROTECTION WITH THE USE OF MODERN METHODS OF ORGANOTHERAPY

Е.S. Petrova

Scientific-research centre of balneology and rehabilitation — a branch of FSBI «North Caucasian federal scientific-clinical centre of Federal Medical Biological Agency», Sochi

Keywords: cardiology, organotherapy, antiischemic protection.

Annotation. In recent decades, intensively began to develop innovative biomedical technologies, them are the widespread techniques of cell, tissue and organ regenerative therapy, showing its efficacy in the treatment of heart disease. One of the directions of these technologies is the application of biologically active substances (BAS) of xenogenic origin of young laboratory or farm animals, obtained during isolated in vitro extracorporeal perfusion with physiological solution. In experiments on small laboratory animals (rats of CD line) preliminary introduction of BAS increased myocardial antiischemic resistance by ~2 times, and in drug poisoning causing all signs of acute myocardial injury in primates, cardioprotective effect of BAS provided the pronounced dynamics of the area and depth of ischemic lesions reduction.

Введение. К настоящему времени накоплено много новых и достаточно давно применяемых данных по коррекции ишемических повреждений миокарда различных способов его фармакологической защиты. Однако, широкая распространённость сердечной патологии, занимающей одно из первых мест в мировой статистике, и обуславливающая высокую летальность больных с заболеваниями сердца, определяет острую необходимость в разработке новых и усовершенствованию существующих способов и технологий противоишемической защиты сердца. Среди них широкое распространение получили современные способы органотерапии, хорошо зарекомендовавшие себя в клинической практике, но недостаточно полно изученные в доклинических исследованиях, что важно для оценки их эффективности в качестве средства противоишемической защиты миокарда.

Уникальные управляющие БАВ [11], входящие в состав инкрета, изменяют функциональная активность клеток «органа-мишени» [7,8,9,12], которые вынужденно переходят в состояние «возбуждения» с высвобождением тепла, активируя тем самым скорость внутриклеточных биохимических процессов для физиологического ответа [6,10], адекватного произведённому действию за счёт изменения скорости синтеза АТФ. Ход последующих событий обусловлен усиленным расходованием АТФ и, как следствие, временным дефицитом энергии, требующим активизации реакций энергетического метаболизма в ответ на изменение параметров внеклеточной среды. Это происходит за счёт безопасного снижения критического содержания АТФ в миокарде с ~2-4 мкМ/г до 0,8-1,0 мкМ/г сырой ткани, избежав апоптоза [2,3]. Последующие события, согласно теории адаптации и адаптивной регуляции гомеостатических систем, реализуется через известные механизмы инициальной гиперфункции, срочной и долговременной адаптации [4,5,6,12]. Реакция «возбуждения», на которую ориентированы органосберегающие технологии, позволяет вмешаться в патологический процесс, разорвав этот «порочный круг» в общем генезе событий. Суть медицинской технологии, предусматривающей действие БАВ ксеногенной природы, позволяет ориентироваться не только на восстановление функции, но и на структуры «органа-мишени». На сегодняшний день доминируют две концепции: одна из них придерживается мнения, что реконструкция морфогенеза – это результат активизации собственных стволовых клеток реципиента, имеющихся, по мнению авторов, в каждой ткани жизненноважных органов. Другая утверждает, что восстановление структуры «органа-мишени» есть результат завершающих этапов долговременной адаптации, реализуемый через формирование системного структурного следа посредством двух равновеликих механизмов: гиперплазии или фиксации скорости энергетического метаболизма на принципиально новом уровне.

В связи с этим цель работы: исследовать эффективность противоишемического действия БАВ ксеногенного происхождения.

В этой связи, перед настоящей работой были поставлены следующие задачи: - Оценить эффективность действия БАВ как средства противоишемической защиты миокарда в эксперименте на мелких лабораторных животных (крысах), в том числе, в условиях повышенных физических и психоэмоциональных нагрузок; - Оценить эффективность действия БАВ при экспериментальном моделировании цитотоксического повреждения миокарда на приматах.

Методы и организация исследования. Работа была выполнена на базе Лаборатории экспериментальной физиологии отдела инновационных биомедицинских технологий НИЦКиР ФФГБУ СКФНКЦ ФМБА России в г. Сочи совместно с сотрудниками Лаборатории иммунологии и биологии клетки ФГБНУ «Научно-исследовательский Институт медицинской приматологии».

Исследования выполнены на 14 половозрелых приматах (Макак-Резус, лат. Macaca mulatta) массой 4,90±1,85 кг, 143 аутбредных крысах линии CD (лат. Rattus norvegicus) массой 175±15 г.

Исследования противоишемической устойчивости миокарда к различным факторам действия выполнены на изолированных сердцах аутбредных крыс линии CD при постоянной регистрации изометрического напряжения покоя на модели изолированного сердца по Langendorf. Регистрацию напряжения миокарда в процессе сердечного цикла (в мм.рт.ст.) осуществляли с помощью датчика и блока давления ЕМТ-311 фирмы «Elema-Schonander» (Швеция) и регистратора АПК ПК. Заданный температурный режим поддерживали с помощью ультратермостата. В качестве модели физической и психоэмоциональной нагрузки применяли методику вынужденного плавания животных по Porsolt в бассейне с пресной водой при +18°С +20°С и дополнительным грузом, составляющим 10% от массы тела животного. Для введения БАВ ингаляторным способом использовали компрессорный ингалятор (небулайзер) Бореал F400 («Флаем Нуова», Италия).

Острое цитотоксическое повреждение миокарда вызывали внутривенным введением препарата инкурон (CBL0137) в объеме 5,0-8,0 мкг/кг массы тела животного. Электрокардиографические исследования по Небу (запись трех двухполюсных отведений, получивших буквенную маркировку – D (Dorsalis), A (Anterior) и I (Inferior)) в условиях лекарственного наркоза (ксила 0,1 мг/кг + золетил 0,05 мг/кг массы тела животного) выполняли на электрокардиографе Поли-Спектр - 8/ЕХ на 1, 3, 5, 8, 15 и 42 день эксперимента. Диагностическая ценность ЭКГ по Небу заключается в том, что отведения A, D, I позволяют зафиксировать патологические изменения в тех участках сердца, которые не фиксируются при стандартной ЭКГ (отведение D наиболее информативно при очаговых изменениях в задней стенке левого желудочка, отведение A – при изменения в переднебоковой стенке, отведение I позволяет зафиксировать очаги ишемии в нижних отделах переднебоковой стенки левого желудочка. Содержание биохимических показателей (АЛТ, АСТ, КФК, КФК -  МВ, К⁺) в сыворотке крови определяли также  на 1, 3, 8, 15 и 42 день исследования на биохимическом анализаторе Liasys 2, AMS (Италия). Для морфологических исследований образцы миокарда фиксировали в 10 %-ном формалине, заливали в парафин, срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, исследовали при увеличении х400.

С целью купирования процесса на этапе констатации острого цитотоксического повреждения миокарда или грубых ишемических его повреждениях, животным внутривенно вводили 5,0 мл БАВ, содержание БАВ ad mass оценивали как 1,79·10^-5 мг.

Полученный материал обрабатывали методом вариационной статистики для малых выборок, представленным в программном обеспечении Microsoft Office Excel 2003, используя в сравнительном анализе среднее значение (M) и среднеквадратическое отклонение (m). Диапазон достоверности (доверительный интервал) p определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение. На рисунке 1 показано, что оптимальным температурным режимом был избран режим +17°С, где продолжительность изотонического плато достаточно большая (30-40 мин), а амплитуда ишемической контрактуры мало и недостоверно отличается от параметров, полученных при температуре +35°С (нормотермии).

Рис. 1. Выбор оптимального температурного режима для исследований эффективности планируемых медицинских действий. Напряжение покоя миокарда в период нормотермической и гипотермической ишемии.

На рисунке 2 показаны четыре стадии умирания сердца: стадия адаптации, стадия «изотонического плато», которая свидетельствовала о продолжительном периоде сохранения установившегося равновесия процессов синтеза и расходования АТФ и сохранности метаболических путей реализации энергетического потенциала сердца. Это и есть период противоишемической резистентности миокарда, который необходимо учитывать при проведении операций на сердце и позволяющий прогнозировать благоприятное восстановление сократительной функции сердца в реоксигенационный период, стадия нарастания изометрического напряжения (время начала нарастания контрактуры), которую можно расценивать как проявление первых признаков дефицита АТФ, характеризуемого неспособностью энергетического метаболизма удержать ионы Ca²⁺ в СПР и снаружи клетки и стадия завершения формирования устойчивой ишемической контрактуры сердца, которая является характеристикой полного энергетического истощения, свидетельствующее о необратимости функциональных нарушений, несовместимых с жизнью и связано с прогрессивно развивающимся некомпенсированным дефицитом АТФ.

Время в минутах   мм.рт.ст.   мм.рт.ст.

Рис. 2. Напряжение покоя миокарда в период гипотермической ишемии

На рисунке 3 показано действие БАВ в условиях тотальной ишемии – предварительная ингаляция БАВ пролонгирует период изотонического плато на 40 минут (р<0,01), завершая процесс формирования ишемической контрактуры на 30 минут позже, чем в контрольной группе (р<0,03), позволяя увеличить резистентность миокарда к ишемии за счёт его внутренних резервов, поскольку иных внешних источников энергии изолированное и неперфузируемое сердце не имеет.

Рис. 3. Напряжение покоя миокарда в период гипотермической ишемии +17°С у животных, получивших однократную ингаляцию БАВ животного происхождения

На рисунке 4 показано, что физическая и психоэмоциональная нагрузка пролонгируют время наступления необратимых ишемических нарушений на 20 минут (p<0,05) и может быть охарактеризована как фактор тренинга, при этом, суммарные функциональные возможности сердца практически не изменились, так как время формирования устойчивой ишемической контрактуры не отличалось от контрольного  (105 мин; p>0,05)

Рис. 4. Напряжение покоя миокарда в период гипотермической ишемии +17°С у животных, предварительно прошедших курс физической и психологической нагрузки купанием в пресной воде

Также установлено, что в сочетании с действием БАВ, такие сердца (после физической и психоэмоциональной нагрузки) погибают значительно позже изотоническое плато их НП пролонгировано на 40 минут (р<0,01), а ишемическая контрактура задерживается на 30 минут (р<0,03), рисунок 5.

Рис. 5. Напряжение покоя миокарда в период гипотермической ишемии +17°С у животных, предварительно прошедших курс физической и психологической нагрузки плаванием в пресной воде, получивших однократную ингаляцию БАВ животного происхождения

При моделировании цитотоксического повреждения миокарда (инкурон) на приматах показано, что исходная клиническая картина пациентов после введения CBL0137 характеризовалась синусовой аритмией, нарушением проводимости, в отдельных случаях, перегрузкой миокарда и во всех случаях ишемическим повреждением миокарда в грудных отведениях с изменениями амплитуды зубца Т (до 7 мм в отдельных случаях) в сторону увеличения и положительным ростом депрессии сегмента ST (3 мм), указывающее на наличие ишемического повреждения в субэндокардиальных отделах передней или задней стенки левого желудочка.

Морфологические исследования показали, что в миокарде приматов, подвергшихся острому воздействию CBL0137, отмечены повреждения кардиомиоцитов: некробиотические изменения, наличие субсегментарных контрактур кардиомиоцитов, что дает возможность предположить ишемию. Установлено неравномерное кровенаполнение миокарда, нарушение реологии крови в виде эритростаза, выявлены признаки возможного нарушения ритма сердца и дистрофии миокарда в виде диффузной лейкоцитарной инфильтрации с преобладанием диапедезных микрогеморрагий и выраженного периваскулярного отека стромы. В артериях мелкого калибра - признаки спазма, плазматического пропитывания стенки (рис. 6).

Рис. 6. Гистологическая картина миокарда примата после введения CBL0137. Участки волнообразной деформации мышечных волокон миокарда (1), выраженный отек межмышечной стромы (2), отсутствие ядер (3), глыбчатость цитоплазмы (4), неравномерное кровенаполнение (5), диффузная клеточная инфильтрация (6), неравномерная окраска кардиомиоцитов (7). Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х400.

Высокие цифры КФК, КФК-МВ, АЛТ и АСТ, их постепенное нарастание позволяют утверждать, что избранный для моделирования препарат CBL0137 обладает высокой степенью не избирательной цитотоксичности.

Внутривенное введение БАВ в дозе 1,79·10^-5 мг вызывает немедленный кардиопротекторный эффект, обеспечивающий выраженную динамику уменьшения зоны и глубины ишемического повреждения. При этом, общую тенденцию можно назвать положительной, подтверждённой не только данными ЭКГ, но и снижением КФК-МВ фракции на 42 день эксперимента в ~2 раза, общей КФК в ~4 раза и нормализацией содержания К⁺ в сыворотке крови.

По результатам выполненных исследований было сделано заключение, что использование БАВ ксеногенного происхождения обеспечивают в избранных моделях повреждения миокарда (модель естественного умирания изолированного сердца и модель острого цитотоксического его повреждения) ярко выраженный противоишемический эффект, подтверждённый клиническими, функциональными и биохимическими методами исследования.

Заключение. Предварительная однократная ингаляция БАВ в дозе 1,79•10^-5 мг позволяет увеличить противоишемическую резистентность миокарда в ~ 2 раза. В сочетании с физической и психоэмоциональной нагрузкой все характеристики кардиопротекторного действия БАВ сохраняются в полном объёме. При моделировании острого цитотоксического повреждения миокарда внутривенное введение БАВ в дозе 1,79•10^-5 мг вызывает немедленный кардиопротекторный эффект, обеспечивающий выраженную динамику уменьшения зоны и глубины ишемического повреждения и сохраняющийся до завершения периода наблюдения, которые подтверждены снижением КФК - МВ фракции, общей КФК и нормализацией К+ в сыворотке крови. 

Список литературы

1. Здравоохранение в России. 2015: Стат.сб. / Росстат. – М., 2015. – 174 с.
2. Лубяко А.А. Механизмы формирования и принципы  диагностики    противоишемической резистентности миокарда / А.А. Лубяко / Дис. ... докт. биол.  наук, М.: 1994, 487 с.
3. Лубяко А.А. Технология коррекции нарушений функции органов, тканей и их систем усовершенствованными методами органотерапии / А.А. Лубяко, В.И. Кирпатовский, В.Н. Слобин, А.В. Звездин, Н.Ю. Александров, Э.Г. Садыков. - М, 2006, 65 с.
4. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.З.   Меерсон. -  М. Медицина, 1984. – 268 c.
5. Пауков В.С. Элементы теории патологии сердца / В.С. Пауков, В.В. Фролов. - М. Медицина, 1982. – 270 c.
6. Фролов В.А. Патологическая физиология / В.А. Фролов, Г.А. Дроздова, Т.А. Казанская, Д.П. Билибин, - М: Демуров, 2002. - 707 с.
7. Хавинсон В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов / В.Х. Хавинсон // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2001. - Т. 132, № 8. - С. 228-229.
8. Blöbel G. Holtzman Memorial Lecture / G. Blöbel // Davis Auditorium, Schapiro Building Wednesday, March 3, 1999.
9. Matunis M.J. GTPase-activating protein to the nuclear pore complex / M.J. Matunis, G. Blobel // J Cell Biol 1998 FEB. – V. 140 (3). – P. 489-498.
10. Metzler D.E. (Мецлер Д.) Биохимия / D.E. Metzler. - М: Мир, 1980. - 606 с.
11. Nickel K.D.R. Ursprungsland: Griechenland / K.D.R. Nickel // Frankfurt-am-Main, 1998. - 11 p.
12. Selye H. Стресс без диcтресса. / H. Selye. - М.: Прогресс, 1979. - 123 с.

References

1. Healthcare in Russia. 2015: Stat. / Rosstat. - M., 2015. - 174 p.
2. Lubyako A.A. Mechanisms of formation and principles of diagnostics of anti-ischemic myocardial resistance / A.А. Lubyako / Dis. ... Doct. Biol. Sciences, Moscow: 1994, 487 p.
3. Lubyako A.A. Technology correction of violations of organs, tissues and their systems by improved methods of organotherapy / А.А. Lubyako, V.I. Kirpatovsky, V.N. Slobin, A.V. Zvezdin, N.Yu. Aleksandrov, E.G. Sadykov. - M, 2006, 65 p.
4. Meerson F.Z. Pathogenesis and prevention of stressor and ischemic heart damage / F.Z. Meerson. - M. Medicine, 1984. - 268 c.
5. V.Paukov. Elements of the theory of cardiac pathology. Paukov, V.V. Frolov. - M. Medicine, 1982. - 270 c.
6. Frolov V.A. Pathological physiology / V.A. Frolov, G.A. Drozdova, Т.А. Kazanskaya, D.P. Bilibin, - M: Demurov, 2002. - 707 p.
7. V.V. Khavinson. Tissue-specific effect of peptides / V.Kh. Havinson // Bull. experiment. Biol. honey. - 2001. - P. 132, No. 8. - P. 228-229.
8. Blöbel G. Holtzman Memorial Lecture / G. Blöbel // Davis Auditorium, Schapiro Building Wednesday, March 3, 1999.
9. Matunis M.J. GTPase-activating protein to the nuclear pore complex / M.J. Matunis, G. Blobel // J Cell Biol 1998 FEB. - V. 140 (3). - P. 489-498.
10. Metzler D.E. (Metzler D.) Biochemistry / D.E. Metzler. - M: The World, 1980. - 606 p.
11. Nickel K.D.R. Ursprungsland: Griechenland / K.D.R. Nickel // Frankfurt-am-Main, 1998. - 11 p.
12. Selye H. Stress without distress. / H. Selye. - Moscow: Progress, 1979. - 123 p.

Сведения об авторах. Екатерина Сергеевна Петрова - младший научный сотрудник, заведующая лабораторией экспериментальной физиологии отдела ИБМТ НИЦКиР ФФГБУ СКФ НКЦ ФМБА России в г. Сочи, Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript., тел. 918-100-74-34.