Наумов С.С., Кильдишева К.В., Арушанян Э.Б. Роль эпифиза в суточных колебаниях болевой чувствительности и гематологических показателей у крыс с адъювантным артритом

Скачать статью в формате PDF

Дата публикации 01.09.2018 г. 

УДК 612+617

РОЛЬ ЭПИФИЗА В СУТОЧНЫХ КОЛЕБАНИЯХ БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У КРЫС С АДЪЮВАНТНЫМ АРТРИТОМ

 С.С. Наумов, К.В. Кильдишева, Э.Б. Арушанян

ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ключевые слова: хронофармакология, эпифиз, мелатонин, ревматоидный артрит.

Аннотация. В статье проведена оценка вклада мозговой железы эпифиза и ее основного гомона мелатонина в  организацию суточных колебаний воспалительного процесса при ревматоидном артрите в эксперименте. Показано, что адъювантный артрит приводит к снижению порога чувствительности к боли и к смещению пика болевых ощущений и гематологических маркеров воспаления на утреннее время. Удаление эпифиза приводило к снижению порога болевой чувствительности. При этом наименьший порог был зарегистрирован в утреннее время. Кроме того эпифизэктомия приводила к изменению суточного профиля гематологических показателей крови крыс. Мелатонин вызвал снижение болевой чувствительности и нивелировал проявления системной воспалительной реакции у крыс с адъювантным артритом.

 

THE ROLE OF EPIPHISIS IN THE DAILY VIBRATIONS OF PATIENT SENSITIVITY AND HEMATOLOGICAL INDICES IN RATS WITH ADJUVANT ARTHRITIS

S.S. Naumov, K.V. Kildisheva, E.B. Arushanyan

FGBOU VO «Stavropol State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation 

Key words: сhronopharmacology, epiphysis, melatonin, rheumatoid arthritis.

Annotation. The contribution of the epiphysis brain gland and its main melatonin hormone to the organization of diurnal fluctuations of the inflammatory process in rheumatoid arthritis in the experiment was assessed in the article. It is shown that adjuvant arthritis leads to a decrease in the threshold of sensitivity to pain and to a shift in the peak of pain and hematological markers of inflammation in the morning. The removal of the epiphysis led to a decrease in the threshold of pain sensitivity. At the same time, the smallest threshold was registered in the morning. In addition, epiphysectomy led to a change in the daily profile of hematological indices of rat blood. Melatonin caused a decrease in pain sensitivity and neutralized manifestations of a systemic inflammatory reaction in rats with adjuvant arthritis.

Введение. Ревматоидный артрит (РА) является заболеванием с четко выраженной суточной  периодичностью. В частности, боль и припухлость в суставах более выражены в ранние утренние часы, а симптом «утренней скованности» является важным диагностическим критерием заболевания [6].

Как известно, в регуляции суточного периодизма активно участвует эпифиз. Его хроноторопная роль тесно связана с изменениями фоторежима и обеспечивается за счет выработки основного гормона мелатонина [2].

В связи с этим, представлялось интересным оценить вклад мозговой железы и мелатонина в  организацию суточных колебаний воспалительного процесса при ревматоидном артрите в эксперименте, что и определило цель настоящего исследования.

Методы и организация исследования. Выполнено 3 серии опытов на 96 белых беспородных крысах- самцах массой 180-230 г. Исследования проводили в разное время суток (в утренние (7.00-8.00) и вечерние (19.00-20.00) часы.  В первой серии изучена болевая чувствительность животных в норме и при моделировании адъювантного артрита (АА). Для этого субплантарно однократно инъецировали 0,1 мл адъюванта Фрейнда. Контролем служила группа крыс (12 особей), получавшая в том же объеме физиологический раствор. До введения АФ и спустя 14 дней у животных осуществляли забор крови и определяли болевую чувствительность с помощью метода «Горячая пластина» (ГП), который предназначен для измерения порога болевой чувствительности в ответ на термическое раздражение [5]. Животное помещали на горячую поверхность пластины (t=55˚С, не более 60 секунд) и регистрировали латентное время вертикальных стоек (ЛВ) и латентное время до первого облизывания лап (ЛВЛ), по которым судили о выраженности боли. 

Во второй серии экспериментов (24 крысы), изучено влияние удаления эпифиза  на болевую чувствительность и гематологические показатели в разное время суток.  С этой целью,  под общим наркозом (золетил 5 мг/кг, внутримышечно) осуществляли эпифизэктомию (ЭЭ) по методике модифицированной на кафедре фармакологии СтГМИ [4]. Контролем служили животные  с ложной операцией, при которой проводили трепанацию черепа  с последующим  разрезом твердой мозговой оболочки. 

В третьей серии (20 крыс), оценивали влияние мелатонина на суточные колебания болевой чувствительности и гематологические показатели при артрите. Мелатонин вводили внутрибрюшинно в дозе  0,1 мг/кг на протяжении 14 дней, в вечерние часы. Контролем служили инъекции физиологического раствора.

   В образцах крови определяли уровень  С-реактивного белка (СРБ) - методом иммунотурбодиметрии реагентом CRPL3 на биохимическом модуле анализатора Cobas 6000, число лейкоцитов -  автоматически на гематологическом анализаторе Sysmеx ХT-2000. У животных с ЭЭ определяли  содержание плазменного мелатонина методом двухстадийного иммуноферментного анализа  на спектрофотметре ImmunoChem-2100 Hicroplate Reader

Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде, с фиксированным световым режимом  (свет включался в 8.00, выключался в 20.00). Все исследования проводились с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986).

Результаты были обработаны с помощью парного критерия Стьюдента в пакете компьютерных программ Biostat. Достоверными считались данные при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Оценка болевой чувствительности интактных крыс в тесте ГП показало, что ЛВ было выше в утреннее время и ниже вечерние часы (20,7±1,7 и 15,4±2,4 соответственно).  У крыс с АА возрастала болевая чувствительность судя по достоверному снижению ЛВ стоек,  как в утренние, так и в вечерние часы. Одновременно нарастала частота облизываний лап (с 4,2±0,3 до 8,4±2,1, P<0,05). При этом менялась суточная динамика болевой чувствительности: ЛВ было достоверно ниже утром, по сравнению с вечерними определениями и группой интактных животных.

У интактных животных уровень лейкоцитов и С-РБ утром был ниже, чем вечером. АА  сопровождался лейкоцитозом и ростом уровня С-РБ, наиболее выраженным в утренние часы (табл. 1).

Таким образом, адъювантный артрит приводит к снижению порога чувствительности к боли и к смещению пика болевых ощущений и гематологических маркеров воспаления на утреннее время.

Удаление эпифиза привело к изменениям суточных колебаний  болевой чувствительности. Выявлено значимое снижение ЛВ вертикальной стойки, наиболее выраженное в утренние часы. Количество облизываний лап было ниже, чем у животных  с ложной операцией. У ложнооперированных животных ЛВЛ и ЛВ вертикальных стоек было несколько выше в начале дня, а к вечеру снижалось (табл. 2). Таким образом, удаление эпифиза приводило к снижению ЛВ реакции на раздражитель, и смещению пика болевых ощущений на утренние  часы.

 

 

 

Таблица 1

Суточная динамика уровня лейкоцитов и С-РБ у крыс с адъювантным артритом

Группы	Время суток	Исходные данные		На 14-е сутки АА
		Лейко-циты, *109/л	С-РБ, мг/л	Лейко-циты, *109/л	С-РБ, мг/л
Интактные (физраствор)	1	6,9±0,2	1,4±0,2	6,7±0,2	1,6±0,2
	2	7,9±0,2	2,4±0,2	7,4±0,2	2,2±0,2
АА	1	6,8±0,2	1,5±0,1	35,2±3,1*	39,2±2,1*
	2	7,7±0,2	2,3±0,2	27,8±2,1*	36,4±1,5*
АА+физ.раствор (контроль)	1	7,2±0,2	1,4±0,1	36,4±2,9*	40,3±4,2*
	2	7,8±0,1	2,8±0,2	28,1±2,7*	37,3±2,3*
АА+физ.раствор (контроль)	1	36,4±2,9	40,3±4,2	41,2±3,7	57,9±3,7
	2	28,1±2,7	37,3±2,3	36,7±3,8	49,4±3,2+
АА+МТ 0,1 мг/кг	1	35,1±2,1	38,9±1,4	19,0±1,6*	23,1±2,1*
	2	28,4±1,5	37,4±0,5	17,6±1,8*	18,7±1,2*

Примечания:

АА – адъювантный артрит; *-достоверность различий по сравнению с интактными животными, p<0,05 (парный критерий Стьюдента)

+ - достоверность различий по сравнению с утренней группой.

1- утренние определения

2- вечерние определения

 

 

Таблица 2

Влияние эпифизэктомии на болевую чувствительность крыс в разное время суток

Время суток	ЛВ облизывания лап	Число облизываний	ЛВ вертикальных  стоек
Ложная операция
утро	6,48±2,06	3,5±1,37	24,6±6,45
вечер	4,98±1,9	5,0±2,0	21,85±5,74
Эпифизэктомия
утро	3,25±1,22+	2,66±1,21	4,26±1,32+
вечер	4,71±1,01*	3,83±1,72	11,76±5,17*+

Примечания:

*-достоверность различий по сравнению с утренними определениями, p<0,05 (парный критерий Стьюдента);

+-достоверность различий по сравнению с ложнооперированной группой, p<0,05 (парный критерий Стьюдента)

 

 

После удаления эпифиза значимо возросло количество лейкоцитов утром с 7,8±0,2 до 12,7±0,2*10⁹/л (Р<0,05) и вечером с 6,9±0,2 до 15,4±0,2*10⁹/л (Р<0,05). Судя по абсолютным значением, повышение лейкоцитов оказалось наиболее выраженным в вечерние часы.  Наблюдался  рост уровень С-реактивного белка в утренние часы. У крыс с ложной операцией также зарегистрирована тенденция к увеличению количества лейкоцитов и С-РБ, однако эти показатели были значимо ниже, чем в группе с эпифизэктомией. При этом суточные колебания оставались без изменений. Удаление эпифиза привело к снижению концентрации плазменного мелатонина. У животных с ЛО количество лейкоцитов в утренние часы оказалось более высоким. Напротив, содержание С-реактивного белка оказывалось выше вечером Концентрация плазменного мелатонина вечером была значимо выше, чем утром (табл. 3).

 

Таблица 3

Суточные колебания гематологических показателей у крыс после  удаления эпифиза

Группы	Вре-мя су-ток	Исходные данные			После эпифизэктомии
		Лейко-циты, *109/л	С-РБ	Мелато-нин, пг/мл	Лейко-циты, *109/л	С-РБ	Мелато-нин, пг/мл
Ложная операция	1	8,1±0,2	1,2±0,1	6,1±0,1	11,2±0,2	3,9±0,2	11,4±0,4
	2	7,3±0,1	1,8±0,1	6,9±0,2	9,8±0,1	4,8±0,1	10,3±0,2
Эпифизэк-томия	1	7,8±0,2	1,3±0,1	28,2±2,1	12,7±0,2#	6,7±0,2#	31,8±2,4
	2	6,9±0,2	1,9±0,2	93,7±5,6*	15,4±0,2*+#	7,1±0,2#	101,5±4,6

Примечания:1-утренние определения, 2-вечерние определения    

           # - достоверность различий по сравнению с исходными данными

Остальные обозначения см. таблицу 1.

 

 Таким образом, удаление эпифиза приводило к снижению порога болевой чувствительности. При этом наименьший порог был зарегистрирован в утреннее время. Кроме того эпифизэктомия приводила к изменению суточного профиля гематологических показателей крови крыс.

Введение животным мелатонина увеличивало ЛВ вертикальных стоек с 6,5±1,1 до 11,4±2,6 секунд в утренние и с 9,0±0,4 до13,6±1,1 секунд в вечерние часы (p<0,05). Кроме того, значимо снизился уровень лейкоцитов и С-РБ (как в утренние так и в вечерние часы) (табл. 1). 

Таким образом мелатонин вызвал снижение болевой чувствительности и нивелировал проявления системной воспалительной реакции у крыс с адъювантным артритом.

В данном исследовании получены  доказательства регулирующего влияния эпифиза на суточные колебания болевой чувствительности и концентрации лейкоцитов и С-реактивного белка  у крыс. Это может быть связано с секреторной активностью эпифиза. Поскольку его удаление совпадает с падением плазменного уровня его основного гормона мелатонина. 

Коррекцию в дезорганизованной динамике  болевой чувствительности и колебаний показателей крови гормон обеспечивает путем регуляции деятельности основного ритмзадающего механизма - супрахиазатических ядер гипоталамуса. При этом имеет значение регуляция мелатонином вторичных осцилляторных структур, участвующих во временной организации эмоционального поведения.

Представленые факты свидетельствуют о том, что  АА вызывает дезорганизацию биологических ритмов, которая проявляется в нарушении суточного профиля болевой чувствительности и гематологических маркеров воспаления. Введение мелатонина крысам с адъювантным артритом нормализовало циркадианный ритм болевой чувствительности, привело к понижению выраженности воспалительной реакции. Это может быть связано с тем что эпифиз участвует  в контроле за периодическими сезонными колебаниями иммунной системы, что должно иметь значение при терапии сезонной патологии, подобной ревматоидному артриту [2].

Мелатонин восстанавливая циркадианные ритмы, нарушенные при хронической боли, улучшает сон, нормализует адаптивные возможности организма. C  другой стороны, гормон, обладая антитревожным действием, способствует снижению тревоги и вегетативных реакций и повышает болевой порог [10].

В нормализации суточного периодизма при адъювантном артрите может иметь значение тот факт, что  мелатонин уменьшает боль за счет опосредованного действия на бензодиазепиновую, опиоидную, серотонинергическую, дофаминергическую, глутаматергическую системы [7,9,11].

Известно, что под влиянием мелатонина происходит ограничение окислительного стресса, в сочетании с противовоспалительными и иммуномодулирующими эффектами [1,3].

Заключение. Таким образом, факты полученные в данном исследовании показали, что адъювантный артрит вызывает дизритмию у крыс, которая проявляется в нарушении суточных колебаний порога болевой чувствительности, а также уровня лейкоцитов и С-реактивного белка в крови животных.  Удаление эпифиза приводит к снижению порога болевой чувствительности в утренние часы. При этом установлено, что нарушается суточная динамика выработки  лейкоцитов, С-РБ и мелатонина. Мелатонин  вызывает анальгезирующий и противовоспалительные эффекты с восстановлением профиля суточных колебаний болевой чувствительности и гематологических показателей.

Литература

1. Арушанян Э.Б. Обезболивающие свойства эпифизарного гормона мелатонина / Э.Б. Арушанян // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. - 75. - № 8. - С. 44-48.
2. Арушанян Э.Б. Мелатонин: биология, фармакология, клиника / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер // Ставрополь. - 2015. – 396 с.
3. Арушанян Э.Б. Противовоспалительные возможности мелатонина / Э.Б. Арушанян, С.С. Наумов // Клиническая медицина. - 2013.-№ 7.-С. 18-22.
4. Ованесов К.Б. Новый подход к удалению эпифиза у крыс / К.Б. Ованесов //  Актуальные проблемы хирургии. - Ставрополь.-1987 –С.173-175.
5. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев // Москва. – Медицина. - 2005. - 832 с.
6. Cutolo M. Chronobiology and the treatment of rheumatoid arthritis/ M. Cutolo // Opin. Rheumatol. -  2012. -  24. - Р.  312-318.
7. Laste G. Melatonin administration reduces inflammatory pain in rats / G. Laste, I. Macedo, J. Rozisky et al. // J Pain Res. - -  5. - Р. 359–362.
8. Maestroni G.J.M. Melatoninin rheumatoid arthitis: synovial macrophages show melatonin receptors / G.J.M. Maestroni, A. Sulli, C. Pizzorni et al. //   NY Acad. Sci. -   2002. - 966. -  Р. 271–275.
9. Mickle A. Antinociceptive effects of melatonin in a rat model of post-inflammatory visceral hyperalgesia: a centrally mediated process / A. Mickle, M. Sood, Z. Zhang et al. // Pain. - - 149. -  Р. 555 – 564.
10. Wilhelmsen M. Analgesic effects of melatonin: a review of current evidence from experimental and clinical studies / M. Wilhelmsen, I. Amirian, J.R. Russel, J. Rosenberg, I. Gogenur // J Pineal Res. -  - 51.  – Р. 270—277.
11. Zanette S. Melatonin analgesia is associated with improvement of the descending endogenous pain-modulating system in fibromyalgia: a phase II, randomized, double-dummy, controlled trial / S. Zanette, R. Vercelino, G. Laste et al. // BMC Pharmacol Toxicol. – 2014. - 15. - Р. 40.

References

1. Arushanyan E.B. Analgesic properties of the epiphyseal hormone melatonin / EB Arushanyan // Experimental and Clinical Pharmacology. - 2012. - 75. - №. 8. - P. 44-48.
2. Arushanyan E.B. Melatonin: Biology, Pharmacology, Clinic / EB Arushanyan, E.V. Beyer // Stavropol. - 2015. - 396 p.
3. Arushanyan E.B. Anti-inflammatory capabilities of melatonin / EB Arushanyan, S.S. Naumov // Clinical medicine. - 2013. - No. 7. - P. 18-22.
4. Ovanesov K.B. A new approach to the removal of the epiphysis in rats / K.B. Ovanesov // Actual problems of surgery. - Stavropol. - 1987 - P. 173-175.
5. Khubriev R.U. Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances / R.U. Khabriev // Moscow. - Medicine. - 2005.-832 p.
6. Cutolo M. Chronobiology and the treatment of rheumatoid arthritis/ M. Cutolo // Opin. Rheumatol. -  2012. -  24. - Р.  312-318.
7. Laste G. Melatonin administration reduces inflammatory pain in rats / G. Laste, I. Macedo, J. Rozisky et al. // J Pain Res. - -  5. - Р. 359–362.
8. Maestroni G.J.M. Melatoninin rheumatoid arthitis: synovial macrophages show melatonin receptors / G.J.M. Maestroni, A. Sulli, C. Pizzorni et al. //   NY Acad. Sci. -   2002. - 966. -  Р. 271–275.
9. Mickle A. Antinociceptive effects of melatonin in a rat model of post-inflammatory visceral hyperalgesia: a centrally mediated process / A. Mickle, M. Sood, Z. Zhang et al. // Pain. - - 149. -  Р. 555 – 564.
10. Wilhelmsen M. Analgesic effects of melatonin: a review of current evidence from experimental and clinical studies / M. Wilhelmsen, I. Amirian, J.R. Russel, J. Rosenberg, I. Gogenur // J Pineal Res. -  - 51.  – Р. 270—277.
11. Zanette S. Melatonin analgesia is associated with improvement of the descending endogenous pain-modulating system in fibromyalgia: a phase II, randomized, double-dummy, controlled trial / S. Zanette, R. Vercelino, G. Laste et al. // BMC Pharmacol Toxicol. – 2014. - 15. - Р. 40.

Сведения об авторах: Станислав Сергеевич Наумов - ассистент кафедры фармакологии ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет», кандидат медицинских наук, доцент; Ксения Владимировна Кильдишева – аспирант кафедры фармакологии ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет»; Арушанян Эдуард Бениаминович – заведующий кафедрой фармакологии ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет», заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор.