Скачать статью в pdf формате

Дата публикации: 01.09.2021
DOI: 10.51871/2588-0500_2021_05_03_7
УДК 591.121

УЧАСТИЕ ЛЕПТИНА В РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ НА УРОВНЕ КОМПЛЕКСА ПРЕ-БЁТЦИНГЕРА

Е.М. Инюшкина, Т.С. Исакова, А.А. Захарушкина, А.Н. Инюшкин

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Самарский национально-исследовательский университет имени академика С.П. Королева, г. Самара, Россия

Ключевые слова: лептин, комплекс пре-Бётцингера, дыхательный объем, частота дыхания, минутный объем дыхания

Аннотация. Лептин, вырабатываемый адипоцитами, оказывает существенное дозозависимое возбуждающее действие на дыхание при введении в ядро солитарного тракта. В настоящем работе исследуются респираторные реакции на микроинъекции (200 нл) 0,1 нМ, 10 нМ и 1 мкМ лептина в комплекс пре-Бетцингера, участвующий в генерации дыхательного ритма.  В ходе работы нами было выяснено, что микроинъекции лептина (10 нМ и 1 мкМ) в комплекс пре-Бётцингера вызывали дозозависимое увеличение минутного объема дыхания в первую очередь за счет увеличения частоты дыхания без выраженных изменений дыхательного объема или максимальной амплитуды диафрагмы или интегрированной ЭМГ наружных межреберных мышц. Увеличение частоты дыхания было в значительной степени результатом значительного снижения продолжительности выдоха в зависимости от дозы, тогда как продолжительность вдоха существенно не изменилась.

PARTICIPATION OF LEPTIN IN RESPIRATORY REGULATION AT THE LEVEL OF THE PRE-BÖTZINGER COMPLEX

E.M. Inyushkina, T.S. Isakova, A.A. Zakharushkina, A.N. Inyushkin

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education “Samara National Research University named after academician S.P. Korolyov", Samara, Russia

Key words: leptin, pre-Bötzinger complex, tidal volume, respiratory rate, respiratory minute volume.

Annotation. Leptin, produced by adipocytes, has a significant dose-dependent stimulating effect on respiration when injected into the nucleus of the solitary tract. In this study we investigate respiratory reactions to microinjections (200 nl) of 0,1 nM, 10 nM, and 1 μM leptin into the Pre-Bötzinger complex, which is involved in the generation of the respiratory rhythm. In the course of our work, we found that microinjections of leptin (10 nM and 1 μM) into the pre-Bötzinger complex caused a dose-dependent increase in the minute volume of respiration primarily due to an increase in the respiratory rate without pronounced changes in the tidal volume or the maximum amplitude of the diaphragm or integrated EMG of the external intercostal muscles. The increase in respiratory rate was largely the result of a significant dose-dependent decrease in expiratory duration, while inspiratory duration did not change significantly.

Введение. Открытие анорексигенного гормона лептина (от греческого слова "лептос" – изящный, красивый, тонкий), выделенного в 1994 году, стало важным событием в современной физиологии.

Лептин регулирует образование и накопление жировой ткани в организме, а также половые особенности распределения жировой клетчатки [1]. Нарушением его секреции в организме стали объяснять возникновение ожирения. В 1994 г. установлено, что секреция этого гормона связана с наличием гена ОВ, участвующего в патогенезе ожирения [2]. Позднее были обнаружены рецепторы лептина на клеточных мембранах мозга: гипоталамуса (в аркуатном и вентромедиальном ядрах), таламуса, пириформной коре [3, 4].

В нашем предыдущем исследовании было показано, что микроинъекции лептина непосредственно в «респираторную» область ядра солитарного тракта  вызывают существенную дозозависимую стимуляцию дыхания, в первую очередь проявляющуюся как увеличение дыхательного объема и величины комплексной активности инспираторных мышц без значительных изменений частоты дыхания или продолжительности дыхательных фаз [5, 6]. Стимулирующий респираторный эффект лептина на дыхательный объем достигался путем ингибирования рефлекса Геринга-Брейера, а также к усилению респираторной реакции на стимуляцию СО2 центральных хеморецепторов, расположенных в ядре солитарного тракта [6].

Комплекс пре-Бетцингера был описан в 1991 году интернациональной группой исследователей как область генерации дыхательного ритма [7]. Было установлено экспериментально, что в локальной области вентролатеральной части продолговатого мозга каудальнее ретрофациального ядра находятся структуры, генерирующие дыхательный ритм [8, 9, 10, 11, 12]. У кошек in vivo комплекс пре-Бётцингера, расположенный в ростральной части n. ambiguus и вентролатеральной области ретикулярной формации каудальнее n. retrofacialis и ростральнее n. lateralis reticularis, был описан в 1995 году [13].

В связи с этим, мы предположили, что введение лептина в данную структуру может играть существенную роль в модуляции дыхательного ритма.

Целью нашего исследования стало изучение респираторных реакций лептина при микроинъекциях в комплекс пре-Бётцингера.

Методы и организация исследования. Эксперименты проводились в соответствии с биоэтическими правилами и нормами обращения с животными и их использования в научных целях. Эксперименты проведены на 12 взрослых крысах обоего пола массой 200–260 г. Крыс анестезировали уретаном (1,5 г/кг внутрибрюшинно, в объеме 3 мл/кг). Производили трахеостомию. Трахеальную канюлю вставляли ​​в нижнюю треть трахеи. Животное фиксировали в стереотаксическом приборе для мелких лабораторных животных. Производили трепанацию черепа, обнажая дорсальную поверхность продолговатого мозга.

Мы использовали стеклянные микропипетки с диаметром наконечника 20-30 мкм для микроинъекций лептина или искусственной спинномозговой жидкости (контрольные микроинъекции) [14, 15]. Производили микроинъекции лептина или контрольного раствора с помощью микрошприца МШ-1 в область комплекса пре-Бётцингера. Лептин растворяли в искусственной спинномозговой жидкости до концентрации 0,1 нМ, 10 нМ или 1 мкМ. Раствор вводили с постоянной скоростью в объеме 200 нл.

Параметры дыхания оценивали по спирограмме и электромиограмме (ЭМГ) диафрагмы и наружных межреберных мышц. Спирограмма регистрировалась с помощью миниатюрного спирографа, соединенного с трахеальной канюлей. Затем регистрировали сигнал со спирографа и записывали на компьютер. С помощью спирограммы измеряли дыхательный объем (Vt, мл), продолжительность вдоха (Ti, с), продолжительность выдоха (Te, с) и общую продолжительность дыхательного цикла (Ttot, с). Затем частота дыхания (f, вдох/мин) рассчитывается как 60 с/Ttot, и минутный объем дыхания (Vi, мл/мин) определяется как произведение Vt и f.

Запись ЭМГ производилась с использованием биполярных стальных игольчатых электродов. ЭМГ диафрагмы регистрировали через разрез в передней брюшной стенке под грудной клеткой справа. ЭМГ наружных межреберных мышц регистрировали в шестом-восьмом межреберье. Электромиограмма регистрировалась с помощью электромиографа и записывалась на компьютере, интегрировалась. Амплитуда респираторной активности на интегрированной ЭМГ (в относительных единицах) использовалась как мера электрической активности инспираторных мышц. Спирограмма и ЭМГ записывались непрерывно на протяжении всего эксперимента, а исходные значения респираторных параметров (в среднем за 30 с данных до микроинъекции) сравнивались с таковыми на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 и 60 мин после микроинъекции.

В конце каждого эксперимента крысу умерщвляли, ствол мозга удаляли и помещали в фиксатор (4% формальдегид в физиологическом растворе) на 2 недели. После этого были сделаны замороженные срезы (50 мкм) для проверки стереотаксически расположенных точек микроинъекции (по треку), согласно атласу Paxinos & Watson [16].

Статистический и графический анализ данных проводили с помощью программного пакета SigmaPlot. Анализ ответов на микроинъекции лептина проводили с помощью теста ANOVA для повторных измерений. Если обнаруживались статистически значимые изменения, проводили последующие апостериорные сравнения с исходными значениями (до введения лептина) с использованием теста Холма-Сидака. Тест Колмогорова-Смирнова использовался, чтобы определить, принадлежит ли выборка к популяции с нормальным распределением. Все значения выражены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистическая значимость указывалась, если P<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Микроинъекция лептина в область комплекса пре-Бётцингера вызвала дозозависимую стимуляцию дыхания. Введение 0,1 нМ лептина не вызывало статистически значимых изменений паттерна дыхания или ЭМГ инспираторных мышц. Поскольку такая концентрация лептина не вызвала респираторных реакций, мы считаем ее подпороговой. Контрольные микроинъекции искусственной спинномозговой жидкости в область комплекса пре-Бетцингера также не вызвали изменений дыхательных параметров. Респираторные реакции на микроинъекции 10 нМ лептина на внешнее дыхание и ЭМГ инспираторных мышц представлены на рис. 1.

Микроинъекция 10 нМ лептина вызвала умеренную стимуляцию дыхания. Этот эффект проявлялся в прогрессирующем увеличении вентиляции (P<0,01: тест ANOVA), которое достигало своего максимума примерно через 15 мин после введения лептина (Рис. 3). На пике эффекта Vi увеличился с 64,3±2,8 до 73,1±2,9 мл/мин (P<0,01: тест Холма-Сидака). Изменение Vi было вызвано увеличением f (P<0,01: тест ANOVA), поскольку Vt не изменилась (Рис. 2). Частота дыхания прогрессивно увеличивалась, и максимальное изменение f произошло примерно через 15 мин, когда f увеличилось с 61,2±2,8 до 72,4±3,5 вдохов/мин (P<0,01: тест Холма-Сидака). Частота дыхания оставалась повышенной и значительно превышала исходное значение в течение 30 минут после инъекции. Анализ показателей респираторного времени выявил снижение Ttot в результате укорочения Te. Продолжительность выдоха постепенно сокращалась (P<0,05: тест ANOVA) в связи с увеличением f, а при пиковом эффекте Te уменьшалось с 0,72±0,04 до 0,59±0,04 с (P<0,01: тест Холма-Сидака). После инъекции 10 нМ лептина не наблюдалось значительного изменения Ti. Максимальная амплитуда интегрированной ЭМГ диафрагмы и наружных межреберных мышц также осталась неизменной при воздействии 10 нМ лептина.

Рис. 1. Респираторные реакции на микроинъекции 10 нМ лептина в комплекс пре-Бётцингера

Примечание. A – исходное состояние; B – 5 мин, C – 20 мин, D – 40 мин после введения лептина. Фрагменты кривых представлены сверху вниз: спирограмма, ЭМГ диафрагмы, ЭМГ интегрированной диафрагмы, ЭМГ наружных межреберных мышц, ЭМГ интегрированных наружных межреберных мышц

Рис. 2. Минутный объем дыхания (A), дыхательный объем (B) и частота дыхания (C) в исходном состоянии (0) и в различные моменты времени (от 1 до 60 минут) после введения 10 нМ лептина в комплекс пре-Бётцингера

Примечание: * – P<0,05, ** – P<0,01

На рис. 3 показано изменение паттерна дыхания и ЭМГ диафрагмы и наружных межреберных мышц на микроинъекции 1 мкМ лептина в комплекс пре-Бётцингера. Введение 1 мкМ лептина привело к значительной стимуляции дыхания, вызывая постепенное увеличение минутного объема дыхания (P<0,001: тест ANOVA), которая становилась максимальной примерно через 20 минут после инъекции лептина (Рис. 4). Минутный объем дыхания увеличился с 77,2±3,2 до 95,5±4,9 мл/мин (P<0,001: тест Холма-Сидака). Увеличение Vi было связано с увеличением f (P<0,001: тест ANOVA) с 64,4±2,7 до 82,3±4,6 вдохов/мин (P<0,001: тест Холма-Сидака). Начало эффекта наблюдалось в течение 3 минут, максимальное изменение частоты дыхания произошло примерно через 20 минут, а полное выздоровление наблюдалось в течение 50 минут (Рис. 4). Не было явных изменений в Vt (Рис. 4) или пиковой амплитуде интегрированной ЭМГ диафрагмы или наружных межреберных мышц после микроинъекции лептина в концентрации 1 мкМ. Повышение частоты дыхания в значительной степени было результатом значительного укорочения Te, тогда как Ti существенно не изменился. Продолжительность выдоха постепенно уменьшалась (P<0,001: тест ANOVA), достигая своего максимума (примерно через 20 мин) с 0,70±0,04 до 0,54±0,05 с (P<0,01: критерий Холма-Сидака).

Рис. 3. Респираторные реакции на микроинъекции 1 мкМ лептина в комплекс пре-Бётцингера

Примечание: A – исходное состояние; B – 5 мин, C – 20 мин, D – 40 мин после введения лептина. Фрагменты кривых представлены сверху вниз: спирограмма, ЭМГ диафрагмы, ЭМГ интегрированной диафрагмы, ЭМГ наружных межреберных мышц, ЭМГ интегрированных наружных межреберных мышц

Полученные результаты подтверждают ранее описанные стимулирующие респираторные эффекты лептина [5, 6, 17]. Полученные нами данные демонстрируют, что лептин оказывает непосредственное стимулирующее действие на дыхание при микроинъекциях в комплекс пре-Бётцингера. После микроинъекции лептина минутный объем дыхания увеличился, прежде всего, в результате значительного увеличения частоты дыхания, а не дыхательного объема. Однако изменений пиковой амплитуды интегрированной ЭМГ диафрагмы или наружных межреберных мышц не наблюдалось. Было зарегистрировано значительное сокращение продолжительности выдоха, тогда как продолжительность вдоха не изменилась. Диапазон эффективных концентраций лептина во вводимом растворе составлял от 10 нМ до 10 мкМ, тогда как лептин в концентрации 0,1 нМ не вызывал респираторных реакций.

Рис. 4. Минутный объем дыхания (A), дыхательный объем (B) и частота дыхания (C) на исходном уровне (0) и в различные моменты времени (от 1 до 60 минут) после введения 1 мкМ лептина в комплекс пре-Бётцингера

Примечание: * P – <0,05, ** P – <0,01, *** – P<0,001  

Заключение. Представленное исследование является доказательством того, что лептин может оказывать стимулирующее респираторное действие при микроинъекциях в комплекс пре-Бетцингера, играя важную роль в генерации дыхательного ритма. Вместе с нашими предыдущими исследованиями и с имеющимися литературными данными, эти результаты предполагают, что лептин может участвовать в процессах регуляции дыхания вместе с метаболическими процессами, с целью стимулирования вентиляции через комплекс пре-Бетцингера.

Список литературы

  1. Montague С.T. Depot- and sex-specific differences in human leptin mRNA expression: implications for the control of regional fat distribution / C.T. Montague, J.B. Prins, L. Sanders, J.E. Digby, S. O’Rahilly  // Diabetes. – 1997. – Vol. 46, N 3. – P. 342-347.
  2. Haffner S.M. Leptin concentrations are associated with higher proinsulin and insulin concentrations but a lower proinsulin/insulin ratio in non-diabetic subjects. / S.M. Haffner, M.P. Stern, H. Miettinen, L. Mykkanen, M.P. Stern // Int J Obes Relat Metab Disord. – 1998. – Vol. 22, N 9. – P. 899-905.
  3. Bennett P.A. Differential expression and regulation of leptin receptor isoforms in the rat brain: effects of fasting and estrogen / P.A. Bennett, K. Lindell, L.M. Carlsson and B. Carlsson // Neuroendocrinology. – 1998. – Vol. 67, № 1. – P. 29-36.
  4. Korbonits M. Leptin levels do not change acutely with food administration in normal or obese subjects, but are negatively correlated with pituitary-adrenal activity / M. Korbonits, P.J. Trainer, J.A. Little, R Edwards, P.G. Kopelman, G.M. Besser, F. Svec, A.B. Grossman // Clin. Endocrinol. – 1997. – Vol. 46, № 6. – P. 751-757.
  5. Inyushkin A.N. Respiratory responses to microinjections of leptin into the solitary tract nucleus. / A.N. Inyushkin, E.M. Inyushkina, N.A. Merkulova // Neurosci. Behav. Physiol. – 2009 – Vol 39. – P. 231-240.
  6. Inyushkina E.M. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. / E.M. Inyushkina, N.A. Merkulova, A.N. Inyushkin // Neurosci. Physiol. – 2010. – Vol 40. – P. 707-713.
  7. Smith J.C. Pre-Bötzinger complex: A brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals / J.C. Smith, H.H. Ellenberger, K. Ballanyi, D.W. Richter, J.L. Feldman // Science. – 1991. – V. 254. – P. 726-729.
  8. Connelley C.A. Pre-Bötzinger complex in cats: respiratory neuronal discharge patterns / C.A. Connelley, E.G. Dobbins, J.L. Feldman // Brain Res. – 1992. – V. 390. – P. 337-340.
  9. Del Negro C.A. Models of respiratory rhythm generation in thepre-Bötzinger complex; III Experimental tests of model predictions / C.A. Del Negro, S.M. Johnson, R.J. Butera et al. // J. Neurophysiol. – 2001. – V. 86. – P. 59-74.
  10. Funk G.D. Generation and transmission of respiratory oscillatons in medullary slices: role of excitatory amino acids / G.D. Funk, J.C. Smith, J.L. Feldman // J. Neurophysiol. – 1993. – Vol. 70. – P. 1497-1515.
  11. Koshiya N. Neuronal pacemaker for breathing visualized in vitro /N. Koshiya, J.C. Smith // Nature. – 1999. – V. 400. – P. 360-363.
  12. Schwarzacher S.W. Respiratory neurons in the pre-Bötzinger region of cats / S.W. Schwarzacher, J.C. Smith, D.W. Richter // Pfluegers Arch. – 1991. – V. 418. – Р. 11-17.
  13. Schwarzacher S.W. Pre-Bötzinger complex in the cat / S.W. Schwarzacher, J.C. Smith, D.W. Richter // J. Neurophysiol. – 1995. – V. 73. – № 4. – P. 1452–1461.
  14. Goodchild A.K. A method for evoking physiological responses by stimulation of cell bodies, but not axons of passage, within localized regions of the central nervous system. / A.K. Goodchild, R.A.L. Dampney, R. Bandler // J. Neurosci. Methods. – 1982. – Vol 6. – P. 351-363.
  15. Lipski J. Limitations of the technique of pressure microinjection of excitatory amino acids for evoking responses from localized regions of the CNS. / J. Lipski, M.C. Bellingham, M.J. West, P. Pilowsky // J. Neurosci. Methods. – 1988. – Vol. 26, № 2. – P. 169-179.
  16. Paxinos, G. The rat brain in stereotaxic coordinates / G. Paxinos, C. Watson // 6th ed. – London: Academic Press. – 2007. – 456 p.
  17. Chang Z. Systemic leptin produces a long-lasting increase in respiratory motor output in rats. / Z. Chang, E. Ballou, W. Jiao, K.E. McKenna, S.F. Morrison & D.R. McCrimmon // Frontiers in Physiol. – 2013. – Vol. 4, № 1. – P. 1-16.

Сведения об авторах: Елена Михайловна Инюшкина – кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии человека и животных Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева, Самара, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Татьяна Сергеевна Исакова – магистрант кафедры физиологии человека и животных Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева, Самара, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript. Анастасия Александровна Захарушкина – магистрант кафедры физиологии человека и животных Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева, Самара, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Алексей Николаевич Инюшкин – доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии человека и животных Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева, Самара, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript..

Information about the authors: Elena Mikhailovna Inyushkina – Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Human and Animal Physiology, Samara National Research University named after academician S.P. Korolyov, Samara, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Tatyana Sergeevna Isakova –Master's student of the Department of Human and Animal Physiology, Samara National Research University named after academician S.P. Korolyov, Samara, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Anastasia Aleksandrovna Zakharushkina – Master's student of the Department of Human and Animal Physiology, Samara National Research University named after academician S.P. Korolyov, Samara, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.; Aleksej Nikolaevich Inyushkin – Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Department of Human and Animal Physiology, Samara National Research University named after academician S.P. Korolyov, Samara, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript..